les bases fondamentales de la cryobiologie

Introduction

D'une manière générale, le problème de la conservation des tissus est celui du blocage ou tout au moins du ralentissement des fonctions cellulaires et de la conservation des structures physico-chimiques qui conditionnent ces fonctions. Les faits naturels montrent qu'un organisme, soumis à l'action du froid voit son activité fonctionnelle diminuer puis s'arrêter.

Si, pour une organisation biologique simple, les basses températures peuvent suspendre les phénomènes chimiques de la vie pour un temps illimité, il n'en est pas de même pour les organismes perfectionnés. De plus, pour un organisme donné, chacune des cellules qui le constituent possède une résistance particulière et en tout cas supérieure à celle de l'organisme considéré dans son ensemble.

1. Conditions générales de conservation des structures et des fonctions cellulaires
2. Choc thermique
3. Limites de déshydratation
4. Vitesse de refroidissement et vitesse de réchauffement
5. Phénomènes intervenant à basse température
6. Conservation à basse température
7. Mesures thermiques
8. Les agents cryoprotecteurs
1. Nature des cryoprotecteurs
2. Fonctions des cryoprotecteurs
3. Cryoprotecteurs et vitesses de refroidissement
9. Annexes

1) Conditions générales de conservation des structures et des fonctions cellulaires

La résistance au froid et en particulier à la congélation dépend de plusieurs facteurs.

Tout d'abord, un refroidissement brusque peut exercer un effet nuisible sur certaines cellules. Il s'agit du CHOC THERMIQUE qui peut intervenir aussi bien au-dessus qu'au-dessous du point de congélation.

D'autre part la CRISTALLISATION DE L'EAU tant à l'extérieur qu'à l'intérieur des cellules est à l'origine de LÉSIONS MÉCANIQUES importantes.

Une autre conséquence de cette cristallisation est la modification du milieu physique dans lequel se trouve les cellules.

La formation de glace entraîne en effet une AUGMENTATION DE LA CONCENTRATION SALINE du milieu jusqu'à une valeur particulière correspondant au point eutectique.

L'augmentation de la concentration en électrolytes entraîne une DÉSHYDRATATION des cellules.

On note avec intérêt que les cellules qui résistent le mieux à la déshydratation sont celles qui résistent le mieux aux basses températures.

2) Choc thermique

Un choc thermique peut se produire à l'occasion du refroidissement brusque de certaines cellules même en l'absence de toute cristallisation.

La zone critique se situe entre + 15°C et 0°C mais on peut observer également un choc thermique entre 0 et -80°C.

Les lésions dues au choc thermique trouvent leur origine au niveau de la membrane cellulaire, du fait de:

• contractions différentielles des composants membranaires,
• fractures mécaniques,
• changements conformationnels de la topographie membranaire.

Les dommages subis sont peu sensibles à la nature des CATIONS présents dans le milieu extracellulaire mais beaucoup plus aux modifications de sa COMPOSITION ANIONIQUE.

De l'anion le moins agressif au plus toxique on note l'ion ACÉTATE, CHLORURE, NITRATE, IODURE, SULPHATE.

Le choc thermique peut être atténué par :

• les agents cryoprotecteurs,
• la présence de PHOSPHOLIPIDES spécifiques (Phosphatidyl Sérine),
• un refroidissement lent,
• l'exposition préalable à des concentrations élevées en sels.

3) Limites de déshydratation

Chez les vertébrés, une déshydratation même partielle à température normale ou subnormale est nuisible pour la plupart des cellules. Selon leur type et leur origine, les cellules ne supportent pas de perdre plus de 20 à 80 % de leur quantité d'eau originelle.

Pour chaque type cellulaire, il existe une limite de déshydratation au-delà de laquelle se produit une altération irréversible des structures cellulaires.

La corrélation entre la résistance d'une cellule à la déshydratation et sa résistance aux basses températures tient à la modification de l'équilibre ionique.

L'augmentation de la concentration en sels observée au cours de la cristallisation de l'eau exerce les effets les plus nuisibles sur la cellule.

Elle provoque la précipitation des protéines et les complexes lipoprotéines qui forment la membrane sont altérés.

De plus, la cristallisation des sels tampons peut entraîner des variations importantes du pH et par suite une dénaturation irréversible des protéines.

L'augmentation de la concentration de certaines molécules ou ions peut provoquer une toxicité cellulaire.

La congélation peut également modifier de façon réversible ou irréversible l'état colloïdal de la cellule. On peut en effet assister à la séparation du système colloïdal cellulaire en deux phases, les particules organiques se séparant de leurs molécules d'eau de liaison pour se solidifier ou se vitrifier.

La théorie de la vitrification du milieu cellulaire qui est en accord avec de nombreux faits expérimentaux ne peut cependant s'accommoder des vitesses de refroidissement et de réchauffement qui sont utilisées dans la pratique courante.

4) Vitesse de refroidissement et vitesse de réchauffement

En matière de congélation de cellules et de tissus de mammifères il n'y a pas de règle absolue.

La meilleure vitesse et le meilleur mode de refroidissement dépendent de facteurs quelquefois contradictoires et dont beaucoup restent encore mal connus.

C'est souvent par l'expérience que l'on arrive à déterminer les meilleures conditions de refroidissement, en précisant la vitesse à laquelle ce refroidissement doit être effectué, les paliers thermiques éventuels, les agents cryoprotecteurs à utiliser, etc...

Ainsi pourra-t-on éviter le choc thermique, l'action nuisible des fortes concentrations salines, l'altération de l'état coiloidal de la structure cellulaire.

On peut cependant faire quelques remarques générales concernant les vitesses de refroidissement et les lésions cellulaires qui leur sont liées.

A la dimension des vitesses de refroidissement utilisées en pratique courante, la NUCLÉATION puis la CRISTALLISATION débutent invariablement dans le compartiment extracellulaire. Il s'en suit que l'équilibre osmotique de la cellule est perturbé et celle-ci se déshydrate partiellement. L'augmentation de la concentration des électrolytes qui en résulte peut conduire à des lésions irréversibles.

Une fois que la formation de glace est commencée, l a VITESSE DE VARIATION DE LA TEMPÉRATURE intervient de façon majeure sur la viabilité cellulaire au cours du refroidissement :

• elle détermine le temps où les cellules restent au-dessus du point eutectique et de ce fait, détermine la durée d'exposition aux hyperconcentrations salines ;
• elle détermine l'allure de la congélation intracellulaire ;
• elle détermine la taille et la forme des cristaux de glace.

Au cours d'un refroidissement lent, les cristaux de glace extracellulaires augmentent de taille et les cellules se contractent tout en étant au contact de solutions salines très concentrées. La phase liquide se congèle ensuite à la température eutectique.

Au cours d'un refroidissement rapide, l'eau se congèle à l'intérieur des cellules sous forme de cristaux petits et imparfaits qui sont relativement instables. Au cours d'un réchauffement trop lent ils se transformeront en cristaux de plus grande taille et plus stables qui pourront être alors néfastes pour les cellules.

L'augmentation de la concentration saline qui résulte de la congélation de l'eau provoque une contraction des cellules qui peuvent atteindre un volume minimum au delà duquel la membrane deviendra perméable aux ions.

La SURVIE DES CELLULES est donc une fonction de la vitesse de refroidissement. Elle passe par une VALEUR MAXIMUM pour diminuer ensuite lorsque la vitesse augmente.

La VITESSE OPTIMALE doit être juste assez basse pour permettre à une cellule de se déshydrater suffisamment et éviter ainsi une congélation intracellulaire prématurée.

Des vitesses trop faibles exposent les cellules à une concentration excessive des solutés pendant une trop longue durée.

De plus, cette vitesse optimale de refroidissement correspond à un VOLUME CRITIQUE de la cellule qui dépend :

• de la PERMÉABILITÉ à l'eau de la membrane cellulaire,
• de la SURFACE de cette membrane,
• du rapport SURFACE/VOLUME de la cellule considérée.

On peut dire en résumé que l'explication la plus simple de l'existence d'une vitesse de refroidissement optimale est que la survie des cellules est déterminée par deux facteurs opposés qui dépendent de la vitesse.

Le facteur dominant, responsable de la mort cellulaire est la formation de glace intracellulaire et son augmentation de taille au cours du réchauffement.

L'hyperconcentration saline qui en résulte exerce des effets néfastes sur les cellules pour des vitesses lentes, lorsque l'eau intra cellulaire - dont le potentiel chimique est élevé - quitte la cellule pour se congeler dans le milieu extra cellulaire.

La SURVIE MAXIMALE est observée dans une certaine zone de vitesses dite ZONE DE TRANSITION dans laquelle les effets combinés des deux types de mécanismes sont atténués.

On aura noté que vitesse de refroidissement et vitesse de réchauffement étaient liées.

D'une façon générale un RÉCHAUFFEMENT RAPIDE est plus bénéfique qu'un processus lent.

Si la vitesse de réchauffement a peu d'effet sur les cellules refroidies lentement, elle a une grande influence sur les cellules refroidies rapidement.

Ces observations tendent à montrer que les lésions dues à la formation de glace ont lieu, au moins partiellement, au cours du réchauffement et non au cours de la formation initiale de la glace lors du refroidissement.

5) Phénomènes intervenant à basse température

Nombreuses sont les preuves des changements biophysiques et biochimiques qui peuvent se produire dans des cellules vivantes à des températures inférieures à 0°C.

De nombreuses espèces de bactéries et de levures survivent et se multiplient à -8°C malgré la congélation du milieu environnant.

On sait que les aliments (viande, poissons, légumes, fruits) en dehors de toute activité microbienne, perdent une partie de leur goût pendant la conservation à -25°C, traduisant ainsi l'activité enzymatique à basse température.

On peut en conclure que si la température de conservation n'est pas suffisamment basse les cellules continueront de vieillir et le temps de leur survie sera limité par le maintien du métabolisme qui se trouvera plus ou moins ralenti.

A des températures comprises entre 0 et -40°C qui sont impropres à conservation de certaines cellules, il se produit des phénomènes de diffusion qui entraînent une modification de l'équilibre ionique du milieu. A plus basse température ces solutions d'électrolytes sont solidifiées sous forme d'eutectiques.

On assiste également à des modifications de l'état cristallin de la glace (croissance cristalline ou recristallisation) pouvant entraîner des lésions mécaniques importantes des structures biologiques.

6) Conservation à basse température

Dans le domaine des sciences biologiques la température de -70°C était considérée comme la limite inférieure au-dessous de laquelle aucun processus vivant ne pouvait persister.

Pour envisager valablement une conservation à long voire très long terme, il faut admettre que des températures inférieures de conservation doivent être retenues.

La plupart des observateurs notent que des cellules congelées en présence de cryoprotecteur (Diméthylsulfoxyde ou Glycérol) ne subissent aucune altération si la température de conservation est inférieure à -130°C.

Il est en effet difficile de concevoir qu'à cette température qui correspond à la vitrification de l'eau, des mécanismes destructeurs puissent encore se produire.

La conservation de certaines cellules particulièrement fragiles pourra nécessiter l'utilisation de températures très basses telle que celle de l'AZOTE LIQUIDE ( -196°C).

On notera pour la "petite histoire" que BECQUEREL avait calculé en 1950 qu'une graine dont la durée de vie serait d'un an entre 20° et 10°C pourrait encore germer, si elle était conservée à la température de -270°C, au bout de ... 71 TRILLIONS 300 MILLIARDS D'ANNÉES!!

Plus tard, ASHWOOD-SMITH et GRANT, en 1977, ont pu conclure que la conservation indéfinie à -196°C était une impossibilité théorique car des cellules conservées à cette température pendant 32000 ans accumuleraient, du fait des radiations ionisantes, autant de dommages que si elles avaient subi une seule irradiation à 600 rads !

7) Mesures thermiques

Puisque les vitesses de refroidissement et de réchauffement peuvent avoir de profonds effets sur la survie des cellules et des tissus, il est important qu'elles soient mesurées quantitativement.

La meilleure information consiste en un tracé des courbes complètes de refroidissement et de réchauffement qui permettent de déterminer :

• le refroidissement avant congélation,
• la place et l'importance de la surfusion (*),
• le début de la cristallisation et la longueur du plateau de changement de phase,
• la vitesse de variation de température après le changement de phase.

L'ensemble de ce tracé constitue l'HISTOIRE THERMIQUE du système considéré et peut être ramené à une mesure unique pour en simplifier la manipulation.

La meilleure mesure de la vitesse de refroidissement est le temps nécessaire pour que la température passe d'environ -5°C (à laquelle la plus grande part du changement de phase est engagée) au dessous de -50°C. Dans cette zone, la température tend à devenir une fonction sensiblement linéaire du temps de telle sorte qu'un nombre moyen unique pour une vitesse de refroidissement ou de réchauffement aura une signification.

* SURFUSION : Au cours de la cinétique de congélation, la surfusion constitue une étape importante et délicate de l'histoire thermique. Le refroidissement d'une solution au-dessous de son point de congélation peut en effet conditionner la nucléation de la glace et par suite le mode de cristallisation.

8) Les agents cryoprotecteurs

Les principales causes de la mort cellulaire étant:

• la formation de glace intracellulaire,
• le contact avec une hyperconcentration saline,

Il s'agira donc, au cours du refroidissement, de maintenir une quantité suffisante d'eau à l'état liquide à la fois dans les compartiments intra et extra cellulaires et qui devra ne pas cristalliser pour rester solvant des électrolytes.

La NUCLÉATION et par suite, la CRISTALLISATION peuvent être prévenues en rendant les noyaux de condensation inactifs par un "EMPOISONNEMENT" CHIMIQUE. Les substances utilisées à cette fin se fixent sur les molécules d'eau par des liaisons hydrogènes. Ces AGENTS CRYOPROTECTEURS sont de différentes nature mais leurs fonctions sont analogues.

8.1) Nature des cryoprotecteurs

Quelle que soit leur structure moléculaire, les cryoprotecteurs sont très solubles dans l'eau. Leur aptitude à former des liaisons hydrogènes avec les molécules d'eau leur permet de la maintenir à l'état liquide à des températures inférieures aux points de congélation commençante des solutions.

La seconde propriété essentielle de ces produits est de présenter une faible toxicité vis-à-vis des cellules qu'ils doivent "protéger".

La TOXICITÉ est une notion difficile à définir car les conditions extérieures à la nature même du produit peuvent entrer en jeu.

Elle dépend en effet :

• de la concentration du cryoprotecteur,
• de la tonicité du milieu,
• du mode de contact des cellules avec le produit.

On parlera préférentiellement de TOXICITÉ INTRINSÈQUE d'un agent cryoprotecteur pour rendre compte de ses interactions biophysiques et biochimiques avec les structures cellulaires.

Les autres conditions pour lesquelles un additif particulier protègera les cellules d'un système biologique donné varieront et dépendront de facteurs tels que le POIDS MOLÉCULAIRE et la PERMÉABILITÉ de la membrane cellulaire à ce produit.

Les agents qui pénètrent dans les cellules ont un faible poids moléculaire (inférieur ou égal à 400). Les agents non pénétrants dont le poids moléculaire est de l'ordre de plusieurs milliers, protègent les cellules par des mécanismes encore mal élucidés.

Le mode d'ADDITION et d'ÉLIMINATION des cryoprotecteurs est en soi un chapitre important de la cryoconservation.

8.2) Fonctions des cryoprotecteurs

D'une façon générale, les cryoprotecteurs modifient les caractéristiques eutectiques des solutions de telle sorte que la quantité de glace formée et par voie de conséquence la concentration saline de la phase liquide sont diminuées.

En abaissant le point de congélation de la solution extracellulaire ils ralentissent la cinétique de sortie d'eau intracellulaire et évitent ainsi à la cellule d'atteindre son volume minimal critique. En atténuant la contraction cellulaire, les cryoprotecteurs évitent les hyperconcentrations salines et les précipitations,

On constate en effet, qu'en présence de 1 % de DMSO, une solution saline isotonique (9 g/l) atteindra la concentration de 50 g/l de NaCI à la température de -5°C. En présence de 5 % de DMSO, cette concentration serait obtenue à -20°C, tandis qu'elle ne serait atteinte qu'à -50°C si la concentration de cryoprotecteur était portée à 10 %. A cette température les dénaturations protéiques sont manifestement moins importantes.

8.3) Cryoprotecteurs et vitesses de refroidissement

Les lésions cellulaires dues au refroidissement sont attribuées à deux facteurs opposés qui dépendent de la vitesse: l'hyperconcentration saline pour les vitesses trop basses; la formation de glace intracellulaire pour les vitesses trop élevées. La survie maximale est observée dans une zone de transition dans laquelle les effets de ces deux types de mécanismes sont atténués.

D'une façon générale, on constate que les cryoprotecteurs protègent les cellules à des vitesses de refroidissement pour lesquels les dommages liés aux "EFFETS DE SOLUTION" (basses vitesses) sont supposés être prédominants.

On constate en effet, qu'en augmentant la concentration d'un agent cryoprotecteur (GLYCÉROL ou DMSO) dans une suspension de cellules refroidies à des vitesses différentes, la VITESSE OPTIMALE est déplacée vers les basses vitesses, tandis que l'amplitude du taux de survie est augmentée.

On constate que la partie relative à la congélation intracellulaire (vitesses élevées) n'est pas affectée par la présence de cryoprotecteur.

Revenant à la notion de ZONE DE TRANSITION définie précédemment, on peut dire que les agents cryoprotecteurs présents au cours de la congélation la déplacent vers les basses vitesses en abaissant le seuil des lésions dues aux effets combinés des sels et de la glace intracellulaire.

9) Annexes

Résumés et figures d'illustration :

1. Conservation des tissus et activité biologique
2. Conditions générales de conservation :
• effets de la congélation
• lésions mécaniques propres
• augmentation de la concentration des électrolytes
• déshydratation
3. Vitesses de refroidissement
4. Effets de la vitesse de refroidissement sur la cristallisation intra et extra cellulaire
5. Congélation intacellulaire
6. Lésions cellulaires provoquées par la congélation
7. Nature des lésions dues à la congélation
8. Influence de la vitesse de refroidissement sur le taux de congélation intra cellulaire
9. Taux de survie de différentes cellules en fonction de la vitesse de refroidissement
10. Vitesse de réchauffement
11. Phénomènes intervenant à basse température
12. Histoire thermique
13. Agents cryoprotecteurs (I)
14. Agents cryoprotecteurs (II)
15. Fonctions des cryoprotecteurs
16. Cryoprotecteur et volume critique
17. Effet de la concentration initiale de DMSO sur la concentration saline pendant la congélation
18. Effet de la concentration de cryoprotecteur sur le taux de survie
19. Effet des cryoprotecteurs sur le taux de survie et le déplacement de la "Zone de Transition" des lésions cellulaires
20. Figure 1, 2, 3 a Variation de l'osmolarité du milieu en fonction du temps
21. Figure 1, 2, 3 b Conséquence sur la variation du volume cellulaire en fonction du temps

* A. Ehrsam - Lyon - France

 

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